Análisis de la apoDDC humana en RasMol

Analizar el fichero de estructura de la proteína asignada (en caso de haber más de uno, elegir el más representativo). Visualizar la proteína con RASMOL (u otro visor equivalente) e identificar, con ayuda del programa, los elementos estructurales y funcionales más relevantes (elementos secundarios, centros activos, sitios de unión a ligandos, dominios reguladores, etc). Una vez localizados, grabarlos como imágenes *.GIF e incluir las imágenes en el CPA, incluyendo los comentarios pertinentes en formato HTML. Sugerencia: para lograr resultados adecuados será necesario “trabajar” el manual del programa “a fondo” y familiarizarse con su lenguaje de comandos. Recuerde que no se pide un simple “catálogo” de imágenes, sino un complemento visual más detallado de la actividad 1. Ambas actividades deben llevarse “en paralelo”, de modo que tanto la elección de los motivos a visualizar como los comentarios sobre su significado estructural y funcional deben inspirarse en la mencionada Revisión Bibliográfica.

En esta actividad van a visualizarse los elementos estructurales de la proteína L-DOPA descarboxilasa (DDC) humana descritos en la actividad 1, pero ahora con el visor de proteínas RasMol. Como ya se ha comentado, esta enzima cataliza la descarboxilación de la L-DOPA, un aminoácido, transformándolo en dopamina, una amina, usando el PLP como cofactor. Estas tres moléculas aparecen en la Figura 1. Esta figura muestra cómo la L-DOPA tiene un grupo carboxilo que está ausente en la dopamina.

Figura 1: Representación en RasMol de la L-DOPA (a), la dopamina (b) y el PLP (c) usando el modelo Sticks y el modelo de color CPK. En el caso de la L-DOPA y la dopamina también se han representado los átomos de hidrógeno, mientras que en el del PLP no. El círculo amarillo resalta la presencia o ausencia de un grupo carboxilo.

Como ya se ha comentado en la actividad 1, la DDC es una enzima con una estructura cuaternaria formada por dos subunidades idénticas (Figura 2.a) [1]. Por otro lado, cada subunidad presenta distintos motivos de estructura secundaria (Figura 2.b).

Figura 2: Representación en RasMol de la apoDDC en el modelo Ribbons. a) Se ha utilizado el modelo de color Chain. La cadena A se ha coloreado de azul y la cadena B de verde. b) Se ha utilizado el modelo de color Structure. Las hélices α aparecen en rosa, las láminas β en amarillo y los giros β en azul.

RasMol nos ofrece información sobre el número de átomos de esta proteína que pertenecen a una región con un determinado tipo de estructura secundaria (Tabla 1). Como cabría esperar, la estructura secundaria que se da con mayor frecuencia es la hélice α, la más abundante de las proteínas debido a su gran estabilidad termodinámica porque es la estructura más simple que puede asumir una cadena polipeptídica como consecuencia de la rigidez del enlace peptídico [2]. En cambio, tan solo un 14 % de la proteína presenta una estructura secundaria de lámina β, un 16 % se encuentra formando giros β y un 19% de la proteína en este estado conformacional abierto característico de la apoenzima carece de cualquier tipo de estructura secundaria.

Tabla 1: Número y porcentaje de átomos de la apoDDC humana que pertenecen a una región de la proteína con una estructura secundaria determinada.

En PDB no hay un fichero con la estructura de la DDC en la forma holo-, por lo que para comparar las diferencias estructurales tiene que recurrirse a el fichero *.pdb de la holoenzima DDC (holoDDC) de riñón de cerdo, una enzima ortóloga con la que presenta una gran identidad de secuencia (88,9%), tal como muestra la Figura 3. Solo se muestra el alineamiento entre las cadenas A, pero dado que las cadenas A y B son idénticas, el alineamiento entre las cadenas B nos ofrece el mismo resultado. Como puede verse, los aminoácidos que componen el centro activo de ambas enzimas son los mismos y estos se encuentran en la misma posición en la secuencia primaria.

Figura 3: Resultado del alineamiento de la secuencia de la cadena A de la apoDDC humana y la holoDDC de riñón de cerdo utilizando el programa de alineamiento de secuencias Water del paquete EMBOSS [3]. Se ha resaltado el alineamiento entre los residuos que componen el centro activo de ambas enzimas.

Del mismo modo que se ha analizado la estructura secundaria de la apoDDC humana también podemos hacerlo con la holoDDC de riñón de cerdo para ver si cambia el porcentaje de cada tipo de estructura secundaria en la proteína (Tabla 2). Como puede verse, aunque la holoDDC de riñón de cerdo tiene 301 átomos más que la apoDDC humana, el porcentaje de cada tipo de estructura secundaria permanece prácticamente invariante (solo cambia para el caso de la hélice α y las regiones sin estructura secundaria definida en una unidad).

Tabla 2: Número y porcentaje de átomos de la holoDDC de riñón de cerdo que pertenecen a una región de la proteína con una estructura secundaria determinada.

Aunque el porcentaje de cada tipo de estructura secundaria sea similar, la apoDDC humana presenta una conformación con una abertura de unos 20 Å que no está presente en la holoenzima del riñón de cerdo. En la Figura 4.a y 4.b puede verse que la distancia entre el carbono α de los residuos de glicina 202 de la cadena A y B es de 19.02 Å, mientras que la distancia entre estos dos residuos en la holoenzima es de tan solo 7,19 Å (Figura 4.c y 4.d).

Figura 4: Representación en RasMol de la distancia en Angstrom entre los residuos de glicina 202 de cada cadena de la de la apoDDC y la holoDDC de riñón de cerdo en el modelo Ribbons. a) y b) La cadena A de la apoDDC humana aparece en azul y el residuo de glicina 202 de la cadena A en naranja, mientras que la cadena B aparece en verde y el residuo de glicina 202 de la cadena B en rojo. c) y d) La cadena A de la holoDDC de riñón de cerdo aparece en azul oscuro y el residuo de glicina 202 de la cadena A en naranja, mientras que la cadena B aparece en azul claro y el residuo de glicina de la cadena B en rojo.

La consecuencia de la conformación abierta de la apoenzima es que quedan expuestos al disolvente los aminoácidos del centro activo (Figura 5.a) y regiones hidrofóbicas (Figura 5.b) que quedan enterradas en el interior de la proteína cuando esta pasa a la conformación de holoenzima (Figura 5.c y 5.d).

Figura 5: a) Representación en RasMol de la apoDDC humana con el modelo Ribbons y de color blanco y de los residuos del centro activo con el modelo Ball & Stick y de color verde, salvo el residuo de lisina 303, que es el residuo que reacciona con el grupo aldehído del PLP [4]. b) Representación mediante un visor online de la apoDDC humana con las regiones hidrofóbicas en rojo y las hidrofílicas en verde [5]. c) Representación en RasMol de la holoDDC de riñón de cerdo con el modelo Ribbons y de color blanco y de los residuos del centro activo con el modelo Ball & Stick y de color verde, salvo el residuo de lisina 303, que es el residuo que reacciona con el grupo aldehído del PLP [4]. El PLP se ha representado de color rosa con el modelo Ball & Stick. d) Representación mediante un visor online de la holoDDC de riñón de cerdo con las regiones hidrofóbicas en rojo y las hidrofílicas en verde [5].

Tal y como hemos visto en la actividad 1, el centro activo de esta enzima puede encontrarse en cinco estados conformacionales distintos (Figura 6) [4]. En la Figura 7 se ha analizado utilizando RasMol a cuál de estas conformaciones se parece más la del centro activo en los ficheros *.pdb de la apoDDC humana (3RBL.pdb) y la holoDDC de cerdo (1SJ6.pdb). En el caso del fichero 3RBL.pdb (Figura 7.a), la estructura del centro activo se parece más a la conformación de la Figura 6.c. Por otra parte, el centro activo del fichero 1SJ6.pdb muestra la conformación de la Figura 6.e, tal y como cabría esperar. La conformación presente en el fichero 3RBL.pdb se corresponde con un paso intermedio en el que la enzima se encuentra entre la forma apo- y la forma holo-, aunque más próxima a la forma apo-, tal y como se vio en la actividad 1. Esta conformación se corresponde a una situación en la que se ha producido una ocupación de 0,5 por el PLP de la cadena A, es decir, el PLP se encuentra en el centro activo de la cadena A (aunque no se representa este cofactor en este fichero *.pdb), pero todavía no se ha formado la base de Schiff PLP-enzima. Por otra parte, en la conformación de holoenzima del fichero 1SJ6.pdb aparece la molécula de PLP dentro del centro activo, pero este debería estar unido por medio de su grupo aldehído al grupo ε-amino del residuo de lisina 303. No obstante, en la Figura 8 puede observarse que el PLP carece del átomo de oxígeno del grupo aldehído, dado que este oxígeno solaparía con el nitrógeno del grupo ε-amino. La distancia entre el carbono 4 del PLP y el nitrógeno del grupo ε-amino de la lisina 303 es de 1,27 Å.

Figura 6: Residuos del centro activo de la DDC y las distintas conformaciones que pueden adoptar. Las líneas discontinuas hacen referencia al esqueleto peptídico del bucle 1 que conecta el dominio N-terminal con el dominio L en el estado apo- (rojo) y holo- (azul) [4].

Figura 7: Representación en RasMol de los aminoácidos del centro activo de la cadena A de la apoDDC humana (a) y la holoDDC de riñón de cerdo (b). Estos aminoácidos son: phe 80 (verde), tyr 79 (azul oscuro), trp 304 (amarillo), lys 303 (rojo), his 302 (rosa), asn 300 (azul verdoso), tyr 274 (blanco), thr 246 (azul claro), his 102 (naranja), ser 149 (verde oscuro), asp 271 (morado). En b) también aparece el cofactor PLP en color mostaza. Los aminoácidos del centro activo se han representado utilizando el modelo Ball & Stick, mientras que el resto de aminoácidos de la cadena A aparecen en blanco representados en el modelo Strands.

Figura 8: Representación en RasMol del residuo de lisina 303 de la holoDDC de riñón de cerdo y del cofactor PLP mediante el modelo Ball & Stick y el esquema de color CPK. El resto de la proteína se ha representado en blanco con el modelo Strands. La distancia entre el carbono 4 del PLP y el nitrógeno del grupo ε-amino de la lisina 303 es de 1,27 Å.

La Figura 9 muestra la disposición bucle 1 de la cadena A y los bucles 2 y 3 de la cadena B tanto en la forma apo- como en la forma holo-, que son las zonas entre las que se produce el contacto entre ambas cadenas, tal y como vimos en la actividad 1. Como puede verse, los bucles 2 y 3 en la apoenzima se encuentran en contacto con el disolvente, mientras que en la holoenzima quedan enterrados en su interior. Llama la atención que en el caso de la apoenzima faltan muchos residuos de los que componen el bucle 2 y bucle 3 que sí están resueltos en la estructura de la holoenzima, aunque ni siquiera aquí aparecen todos los residuos. Esto se debe a que son zonas muy flexibles responsables del desplazamiento del dominio L de la proteína cuando pasa de la forma apo- a la forma holo-, por lo que no se ha conseguido resolver su estructura tridimensional. Para confirmar esta hipótesis se ha visualizado la proteína con el modelo de color Temperature (Figura 10), que muestra en colores cálidos los átomos cuya posición se ha determinado con una mayor incertidumbre [6]. Como puede verse, estos bucles coinciden con zonas de la proteína que presentan colores cálidos (rojo, naranja), sobre todo aquellos residuos adyacentes a residuos sin determinar. En especial, el bucle 3, que es conocido como el bucle flexible, es el bucle del que se conoce con menor precisión las coordenadas atómicas, tal y como cabría esperar.

Figura 9: Representación en RasMol de la apoDDC humana (a) y la holoDDC de riñón de cerdo (b) mediante el modelo Backbone. En azul se ha representado el bucle 1 de la cadena A (residuos del 66 al 84), en verde el bucle 2 de la cadena B (residuos del 100 al 110) y en rosa el bucle 3 (bucle flexible) de la cadena B (residuos del 323-357).

Figura 10: Representación en RasMol de la apoDDC humana (a) y la holoDDC de riñón de cerdo (b) mediante el modelo Backbone y el esquema de color Temperature. El bucle 1 de la cadena A (residuos del 66 al 84), el bucle 2 de la cadena B (residuos del 100 al 110) y el bucle 3 (bucle flexible) de la cadena B (residuos del 323-357) se han resaltado con un mayor grosor.

En la actividad 1 también se propone que el cofactor PLP es transferido desde la PLK, enzima responsable de su fosforilación a partir de su precursor, hasta el centro activo de la apoDDC. Esta hipótesis se basa en el hecho de que existe una gran complementariedad estructural entre el dímero PLK y la hendidura de la apoDDC. Por tanto, es posible que dos moléculas de PLP unidas a la PLK encajen perfectamente con los centros activos de la apoDDC abierta (Figura 11) [4]. Por otro lado, no es posible que se produzca la interacción entre la PLK y la holoDDC, dado que esta última solo posee un acceso al centro activo a través de una pequeña apertura cargada positivamente de unos 7 Å (Figura 12).

Figura 11: Representación en RasMol de la apoDDC humana (a) y la PLK humana (b) mediante el modelo Spacefill. a) La cadena A se ha representado en azul, la cadena B en verde y los residuos del centro activo en naranja. b) La cadena A se ha representado en azul claro, la cadena B en azul oscuro y los residuos del centro activo en naranja. A la izquierda aparece una visión frontal de la PLK y a la derecha una visión trasera.

Figura 12: Representación en RasMol del PLP en el interior de la holoDDC de riñón de cerdo mediante el modelo Spacefill y el esquema de color Charge, donde los átomos cargados positivamente se colorean en azul y los átomos cargados negativamente en rojo. Este esquema no asigna a cada carga un valor fijo, si no que en base al mayor y el menor valor de carga interpola colores entre el azul y el rojo. Por ello, el verde no puede ser considerado como sin carga neta. El PLP se ha representado con el modelo Sticks y el esquema de color CPK.

Bibliografía

1. Schneider, G., Käck, H., & Lindqvist, Y. (2000). The manifold of vitamin B6 dependent enzymes. Structure, 8(1), R1-R6.
2. Nelson DL and Cox MM: Lehninger. Principios de Bioquímica. 5ª Ed., Omega, Barcelona, 2009.
3. https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/. Fecha de acceso: 20 de junio de 2019.
4. Giardina, G., Montioli, R., Gianni, S., Cellini, B., Paiardini, A., Voltattorni, C. B., & Cutruzzolà, F. (2011). Open conformation of human DOPA decarboxylase reveals the mechanism of PLP addition to Group II decarboxylases. Proceedings of the National Academy of Sciences, 108(51), 20514-20519.
5. https://www.rcsb.org/structure/3rbl. Fecha de acceso: 20 de junio de 2019.
6. Trueblood, K. N., Bürgi, H. B., Burzlaff, H., Dunitz, J. D., Gramaccioli, C. M., Schulz, H. H., ... & Abrahams, S. C. (1996). Atomic dispacement parameter nomenclature. Report of a subcommittee on atomic displacement parameter nomenclature. Acta Crystallographica Section A: Foundations of Crystallography, 52(5), 770-781.
7. RasMol V2_7_2_1 Manual in Spanish.