Preparar un
conjunto de funciones biotools que permitan automatizar el cálculo de distancias interatómicas,
ángulos de enlace y ángulos de torsión a partir de las coordenadas
proporcionadas desde un TPDB. Con ayuda de estas herramientas, desarrollar una
aplicación Free Pascal/Lazarus que permita construir el diagrama de
Ramachandran de la proteína importada. Analizar con este programa algunas de
las estructuras de la proteína asignada e incluir el procedimiento y los
resultados obtenidos en el CPA. Para confirmar la corrección de los cálculos,
incluya también una tabla de ejemplo de los diez primeros residuos, con los
valores de torsión calculados y los observados directamente mediante la
herramienta “set picking torsión” de RASMOL.
Para llevar a cabo esta actividad se ha
creado una aplicación Free Pascal
denominada ramachandran.exe, que
permite calcular los ángulos ϕ y ψ de una proteína, utilizando para ello la
función ramachandran de la libería biotools. Después, estos ángulos pueden
representarse gracias a otra función de biotools,
la función plotXY.
- La función ramachandran requiere un único argumento de tipo TPDB y la salida es de tipo TTablaDatos, es decir, una matriz bidimensional de números reales. Dentro de esta función se utiliza la función angulodetorsion, también presente en la librería biotools, que permite calcular los ángulos de torsión y requiere 4 argumentos de tipo TPunto consistentes en las coordenadas atómicas de los átomos necesarios para calcular un ángulo de torsión. La función angulodetorsion a su vez también hace uso de otras funciones biotools que permiten operar con vectores, como la función difev, que permite restar dos vectores, la función PVectorial, que calcula el producto vectorial de dos vectores, la función PEscalar, que calcula el producto escalar entre dos vectores y la función modulo, que calcula el módulo de un vector.
- La función plotXY requiere múltiples argumentos como ya se ha explicado en la actividad 2, aunque los que debemos seleccionar, es decir, los que no tienen un valor por defecto son:
- Un parámetro de tipo TTablaDatos: la matriz resultante de la ejecución de la función ramachandran.
- Un parámetro de tipo TImage, que va a permitir establecer el objeto del formulario que va a utilizar la función para pintar.
- Cuatro parámetros de tipo real. Estos parámetros van a permitir establecer los límites inferiores y superiores de los ejes. En este programa van a seleccionarse los siguientes valores:
- minX (valor mínimo de X): -180.
- maxX (valor máximo de X): +180.
- minX (valor mínimo de X): -180.
- maxX (valor máximo de X): +180.
Antes de discutir la información que puede
aportarnos este programa vamos a profundizar en qué consiste el gráfico de
Ramachandran y para qué se utiliza. Fue desarrollado por G. N. Ramachandran, un
físico indio y consiste en una representación de los ángulos de torsión ϕ y ψ de
una proteína. El esqueleto covalente de una proteína puede tener tres ángulos
de torsión: el ángulo ϕ, el ángulo ψ y el ángulo ω:
- El ángulo ϕ es el ángulo de torsión que forman el carbono carbonílico de un residuo y el nitrógeno, el carbono α y el carbono carbonílico del siguiente residuo.
- El ángulo ψ es el ángulo de torsión que forman el nitrógeno, el carbono α y el carbono carbonílico de un residuo junto con el nitrógeno del átomo siguiente.
- El ángulo ω es el ángulo de torsión que forma el carbono α y el carbono carbonílico de un residuo junto con el nitrógeno y el carbono α del siguiente residuo [2].
Debido a la rigidez del enlace peptídico el ángulo
ω suele tener un valor de 180º. Solo en casos raros es de 10º para un enlace
peptídico cis, que implica un residuo
de prolina. Por eso, los ángulos de torsión que ofrecen información sobre la
estructura secundaria de la proteína son los ángulos ϕ y ψ, dado que en la
cadena polipeptídica los enlaces N-Cα y Cα-C pueden rotar libremente [2].
Un gráfico de Ramachandran consiste en un
gráfico bidimensional en el que se representa el ángulo de torsión ϕ en el eje
de abscisas y el ángulo de torsión ψ en el eje de ordenadas (Figura 1). La estructura secundaria de
un fragmento de cadena polipeptídica define el tipo de ángulos de torsión que
presentan los átomos que forman parte del esqueleto covalente de la proteína. Por
otra parte, existen zonas del gráfico prohibidas, es decir, combinaciones de
ángulos de torsión ϕ y ψ que nunca van a darse. Esto se debe a que se trata de
ángulos que provocan colisiones entre los átomos si estos se consideran como
esferas rígidas con un radio igual al radio de van der Waals y estos ángulos se
corresponden con conformaciones de la cadena polipeptídica no permitidas. Estos
impedimentos estéricos están provocados en general por el carbono metilénico de
la cadena lateral. Únicamente los residuos de glicina pueden presentar este tipo
de ángulos de torsión, pues su cadena lateral consiste solo en un átomo de
hidrógeno. La presencia de estas zonas prohibidas también permite evaluar la
calidad de la estructura tridimensional que se ha determinado para una
proteína, por lo que el gráfico de Ramachandran resulta de gran utilidad en
estos casos. En la Figura 1 se
observan zonas coloreadas en azul oscuro y zonas en azul claro. Las zonas
coloreadas en azul oscuro se corresponden con ángulos de torsión que pueden
presentar las proteínas sin que se produzcan impedimentos estéricos. En cambio,
las zonas en azul claro muestran las regiones permitidas si se consideran
radios de van der Waals ligeramente más pequeños, lo que permite la aparición
de una nueva región que se corresponde con una conformación de hélice levógira.
Cabe destacar que resulta lógico que la conformación de lámina β se corresponda
con una zona del gráfico próxima a los ángulos de torsión de 180º y -180º. Esto
se debe a que en realidad la conformación de lámina β consiste en una hélice
muy estirada en la que solo hay un único residuo por vuelta de hélice, en
contraste con la hélice α, en la que hay 3,6 residuos por vuelta de hélice [2].
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Figura 1: Gráfico de Ramachandran y relación entre distintas combinaciones de ángulos de torsión ϕ y ψ y estructura secundaria de la cadena polipeptídica [2].
Una vez que se ha aclarado la información que nos aporta este gráfico vamos a ver el resultado de ejecutar el programa ramachandran.exe con el fichero 3RBL.pdb, que se corresponde con la L-DOPA descarboxilasa humana en forma de apoenzima (apoDDC humana) (Figura 2). A la izquierda se ha representado el gráfico de Ramachandran de esta proteína y a la derecha los ángulos de torsión ϕ y ψ expresados en grados, junto con los residuos a los que se corresponden estos ángulos, es decir aquellos residuos que aportan el átomo de nitrógeno, el carbono α y el carbono carbonílico para el cálculo del ángulo de torsión (tres de los cuatro átomos necesarios).
Tanto los primeros ángulos de torsión de cada
cadena polipeptídica como los últimos no se han calculado para mayor
simplicidad, ya que el primer residuo de un polipéptido solo posee ángulo ψ y
el último solo ángulo ϕ. Por otro lado, la función ramachandran es capaz de discriminar entre el último residuo de una
cadena polipeptídica y el primero de la siguiente para que no se calcule el
ángulo de torsión entre estos dos residuos, que no están enlazados. Esto
permite utilizar esta función con proteínas con estructura cuaternaria, como es
el caso de la apoDDC humana. Además, cuando se da este caso la función asigna
el valor 0 a los ángulos de torsión. Esto se traduce que en la representación
gráfica aparecerá un punto sobre el origen de coordenadas, tal y como puede
observarse para el caso de la apoDDC humana (Figura 2).
Como cabría esperar, los puntos se concentran
en distintas zonas:
- En la parte central a la izquierda se observa un gran cúmulo que se corresponde con los ángulos de torsión que se encuentran en la proteína formando hélices α. Puede verse una gran densidad de puntos mayor que en ningún otro cúmulo. Esto se explica porque la hélice α es la estructura secundaria más abundante de la proteína. En concreto, en la actividad 6 vimos que un 51% de los átomos de la proteína se encuentran formando parte de una hélice α.
- En el extremo izquierdo superior se observa otro cúmulo más disperso y menos denso que el anterior. Estos ángulos de torsión se corresponden con aquellos residuos que forman láminas β en la proteína, que en el caso de la apoDDC un 14% de sus átomos forman parte de una lámina β.
- También puede observarse un cúmulo menos denso en la parte central a la derecha. Estos ángulos de torsión en teoría deberían corresponderse con hélices levógiras. No obstante, esta proteína carece de este tipo de estructura secundaria, tal y como se ha visto en la actividad 6. Por tanto, lo más plausible es que estos ángulos de torsión se correspondan con porciones de la proteína que carecen estructura secundaria o con los giros β, que se caracterizan por presentar ángulos de torsión con valores cercanos a los de estos puntos.
- Por otro lado, se observa un pequeño cúmulo en la parte inferior a la izquierda. Estos ángulos de torsión también se corresponderán con porciones de la proteína sin estructura secundaria definida.
- Por último, pueden verse algunos puntos que coinciden con las zonas prohibidas que hemos visto en la Figura 1. Si se comprueba la relación entre los residuos y los ángulos de torsión contenidos en el Memo, así como la lista de residuos con ángulos de torsión en zonas prohibidas de la Figura 6, puede observarse que estos residuos no son glicinas. Esto nos indica que la estructura cristalográfica de la que disponemos no es perfecta. Según estos ángulos de torsión algunos residuos presentan posiciones forzadas, por lo que lo más probable es que estas no sean sus localizaciones reales.
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| Figura 2: Interfaz del ejecutable ramachandan.exe. |
Otra característica
más que ofrece el programa ramachandran.exe
es que podemos seleccionar el color del perímetro del circulo con el que se
representa cada punto (color pluma), así como el relleno de estos puntos (color
relleno). Como la función plotXY
ofrece la opción de no borrar el gráfico esto puede utilizarse para representar
solapados varios gráficos de Ramachandran correspondientes con distintas
subunidades de una proteína (Figura 3) o distintas proteínas (Figura 4).
En la Figura 3 puede observarse cómo la
subunidad A y B no presentan exactamente los mismos ángulos ϕ y ψ a pesar de
tener una secuencia idéntica. Esto se debe a que, como se ha comentado en la
actividad 1, el homodímero no es simétrico, y en la forma apo- la subunidad A
se encuentra en una conformación más parecida a la conformación cerrada de la
holoenzima que la subunidad B [3]. Por otro lado, en esta figura se indica a la
derecha cómo representa este programa los ángulos de torsión cuando se han
cargado varias proteínas. La información contenida en este Memo no se elimina, sino que los nuevos ángulos de torsión
calculados se añaden a los anteriores.
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| Figura 3: Ejecución del programa ramachandran.exe superponiendo el gráfico de Ramachandran de la subunidad A (en azul) y la subunidad B (en amarillo) de la apoDDC humana. |
La Figura 4 demuestra cómo todas las
proteínas presentan aproximadamente la misma distribución de valores de ángulos
de torsión ϕ y ψ y cómo hay zonas prohibidas, como se ha comentado al inicio de
esta actividad.
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| Figura 4: Ejecución del programa ramachandran.exe superponiendo el gráfico de Ramachandran de los ficheros 3RBL.pdb (en rojo), 1A00.pdb (en naranja), 1AFD.pdb (en amarillo), 1AHI.pdb (en verde), 1BHS.pdb (en azul) y 1BUD.pdb (en morado). |
Por otra parte, en
la actividad 6 se ha visto que tanto la apoDDC humana como su ortologa holoDDC
de riñón de cerdo poseen porcentajes similares de los distintos tipos de
estructura secundaria. La Figura 5 muestra un solapamiento del gráfico
de Ramachandran de estas dos proteínas que confirma que, efectivamente, ambas
proteínas poseen ángulos de torsión muy similares. Los ángulos de torsión que
más variarán serán aquellos que se correspondan con residuos de las zonas más
flexibles de la proteína responsables del giro del dominio L y del paso de la
proteína de la conformación abierta a la conformación cerrada.
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Figura 5: Ejecución del programa ramachandran.exe superponiendo el gráfico de Ramachandran de apoDDC humana (en amarillo) y la holoDDC de cerdo (en azul).
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También podemos
visualizar el gráfico de Ramachandran con la herramienta online Uppsala Ramachandran
Server [4], que genera
este tipo de gráfico (Figura 6),
para compararlo con el gráfico generado por la aplicación ramachandran.exe. Si se compara estos gráficos con los obtenidos
con el ejecutable ramachandran.exe (Figura 3) puede observarse que los
puntos coinciden. Además, la ventaja que presenta la herramienta online es que permite visualizar qué
residuos presentan ángulos de torsión ϕ y ψ que caigan dentro de las zonas
permitidas (zona sombreada) o prohibidas (zona en blanco). La Figura 7 muestra una lista de los
residuos cuyos ángulos de torsión caen en las zonas prohibidas y, por
consiguiente, lo más probable es que sus localizaciones reales no sean estas.
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Figura 6: Gráfico de Ramachandran de la subunidad A (a) y de la subunidad B (b) de la apoDDC humana obtenido con la herramienta online Uppsala Ramchandran Server [4].
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| Figura 7: Lista de residuos de la apoDDC humana que poseen valores de ángulo de torsión ϕ y ψ que caen en zonas prohibidas en el gráfico de Ramachandran obtenida mediante la herramienta online Uppsala Ramchandran Server [4]. |
Para terminar, la Figura 8 muestra lo valores de los ángulos de torsión calculados con el programa de visualización de proteínas RasTop. Si los comparamos con los valores de la Figura 2 podemos ver cómo existen pequeñas variaciones, pero en realidad son iguales. Estas variaciones se deben a los decimales que se tienen en cuenta a la hora de calcular los ángulos de torsión.
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Figura 8: Ángulos ϕ y ψ de los primeros 16 residuos de la apoDDC humana, calculados con el programa de visualización de proteínas RasTop.
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Bibliografía
- Apuntes de clase de la asignatura “Ingeniería de Proteínas” del Grado en Bioquímica.
- http://www2.udec.cl/~jmartine/Capitulo3.htm. Fecha de acceso: 20 de junio de 2019.
- Giardina, G., Montioli, R., Gianni, S., Cellini, B., Paiardini, A., Voltattorni, C. B., & Cutruzzolà, F. (2011). Open conformation of human DOPA decarboxylase reveals the mechanism of PLP addition to Group II decarboxylases. Proceedings of the National Academy of Sciences, 108(51), 20514-20519.
- http://eds.bmc.uu.se/ramachan.html. Fecha de acceso: 20 de junio de 2019.
