Suponga que se está planteando rediseñar la proteína asignada, reemplazando la fenilalanina a la que se refiere el apartado 8 por una Y (tirosina). Denominaremos a esta proteína mutante mut01. Evalúe las distorsiones estéricas que tal cambio podría ocasionar en el entorno inmediato de la posición afectada y elabore un breve informe con las conclusiones obtenidas. Para ello calcule las coordenadas del nuevo átomo de oxígeno, e inclúyalas en el fichero PDB (¡haga una copia primero y renómbrela como mut01!). Visualice de nuevo el entorno del residuo modificado con ayuda del script desarrollado en el apartado 7 y grábelo como imagen GIF en una orientación equivalente. Imprima ahora la imagen e inclúyala en el cuaderno de actividades junto con una breve exposición de las conclusiones obtenidas.
Para esta actividad
se ha creado un programa denominado convertphetotyr.exe, que permite
cargar las líneas ATOM de un fichero *.pdb en un objeto Memo,
seleccionar el primer residuo de fenilalanina, transformarlo en un residuo de
tirosina y generar un nuevo fichero *.pdb de este mutante, que puede ser
visualizado en RasMol con los parámetros especificados por el usuario.
Para efectuar esta
mutación dirigida in silico se han tenido en cuenta las características
estructurales de estos aminoácidos. Una fenilalanina se diferencia de una
tirosina en que la tirosina posee un grupo -OH en la posición para- del
anillo aromático (Figura 1), por
lo que para realizar esta sustitución lo único que debe hacerse es añadir este
grupo funcional a la fenilalanina correspondiente. Como los átomos de hidrógeno
no aparecen normalmente en los ficheros *.pdb hemos considerado al grupo
-OH como una única esfera de diámetro superior a un átomo de oxígeno, pero
inferior que el espacio ocupado por un grupo -OH. Para saber dónde colocar este
nuevo grupo funcional, la aplicación desarrollada primero calcula la distancia
media entre los grupos -OH de todas las tirosinas de las proteínas y el carbono
ζ correspondiente, que es el átomo de carbono del anillo aromático al que se
enlaza el grupo -OH. Una vez que se conoce la distancia a la que se encuentra
el grupo -OH es necesario saber en qué posición ubicarlo. Para ello, se ha
considerado que su posición se encontrará en el mismo plano que el plano del
anillo aromático. Para calcular las coordenadas atómicas de este grupo
funcional se han utilizado funciones biotools relacionadas con
operaciones con vectores que ya se han explicado en la actividad 2. A
continuación, el programa convertphetotyr.exe es capaz de crear una
nueva línea ATOM en un fichero *.pdb para este nuevo grupo
funcional, asignarle un número de serie, de modo que el número de serie de los
átomos situados después aumenta en una unidad y cambiar el identificador de
tres letras de PHE a TYR en todas las líneas ATOM de todos
los átomos del residuo mutado. Por último, puede ejecutarse RasMol para
visualizar los resultados. La Figura 2
muestra la interfaz de este programa, resaltando en rectángulos rojos las
líneas ATOM del primer residuo de fenilalanina de la apoDDC humana y del
residuo mutado en el caso del mutante generado.
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| Figura 1: Fenilalanina a la izquierda y tirosina a la derecha. El grupo hidroxilo de la tirosina se ha resaltado con una circunferencia de color rojo. |
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| Figura 2: Ejecución del programa convertphetotyr.exe con el fichero 3RLB.pdb. Los rectángulos rojos señalan las líneas ATOM de los ficheros 3RBL.pdb y mut01.pdb. |
Por otra parte, la Figura 3 muestra
el microentorno de la fenilalanina en la proteína silvestre y la tirosina en el
mutante. Como puede observarse, este cambio no provoca la aparición de
impedimentos estéricos en la proteína. Son dos aminoácidos estructuralmente muy
parecidos y el espacio de más que requiere el grupo hidroxilo de la tirosina
está disponible, ya que el átomo más próximo al grupo -OH está a una distancia
de 3,68 Å, muy por encima de la distancia necesaria para que se forme un enlace
covalente. Esto, sumado al hecho de que el residuo de fenilalanina 6 de la
apoDDC humana parece no tener ninguna función, podría llevar a pensar que esta sustitución
no tendría ninguna repercusión negativa sobre el plegamiento, la estructura y
la función de la enzima. Sin embargo, la fenilalanina es un aminoácido apolar,
mientras que la tirosina es polar como consecuencia de tener un grupo
hidroxilo. La fenilalanina 6 de la apoDDC humana está en el interior de la
proteína, por lo que esta mutación puede provocar cambios en la conformación de
la proteína, dado que el residuo de tirosina polar tendería a ubicarse en la
superficie de la proteína en contacto con el disolvente acuoso. Esto podría
contrarrestarse si la tirosina 6 encontrase un átomo de hidrógeno enlazado a un
átomo de nitrógeno u oxígeno próximo y en la orientación adecuada que
permitiera que la polaridad del grupo -OH se estabilizara mediante un enlace de
hidrógeno, pero la Figura
3.b muestra que este
no es el caso.
Por tanto, lo más probable es que la sustitución de la fenilalanina 6 de
la apoDDC humana por un residuo de tirosina tendrá consecuencias negativas sobre
su función. A pesar de esto, esta predicción computacional no nos puede
garantizar que esto ocurra, tendría que llevarse a cabo esta mutagénesis
dirigida en un laboratorio y experimentos que permitieran corroborarlo.
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| Figura 3: Visualización en RasMol de los ficheros 3RBL.pdb (a) y mut01.pdb (b). Debajo de cada figura se ha indicado los parámetros contenidos en el fichero de instrucciones que se ha utilizado al ejecutar RasMol desde el programa convertphetotyr.exe. |
Bibliografía
- Apuntes de clase de la asignatura “Ingeniería de Proteínas” del Grado en Bioquímica.
- RasMol V2_7_2_1 Manual in Spanish
- https://wiki.freepascal.org/. Fecha de acceso: 19 de junio de 2019.
