Cuaderno de Actividades de Ingeniería de Proteínas: Perfil hidrofóbico y anfipatía axial de un segmento peptídico

Elabore una herramienta informática que permita calcular la antipatía de hidrofobicidad de un segmento de secuencia peptídica mediante el cálculo de momentos de Eisenberg y mediante el espectro de potencias de Fourier de Stroud. Compare los resultados de ambos procedimientos obteniendo las gráficas correspondientes al perfil antipático de un segmento de secuencia C-terminal de 20 residuos de la proteína asignada.

En esta actividad vamos a hacer un estudio exhaustivo de la anfipatía de hidrofobicidad de la L-DOPA descarboxilasa humana en forma de apoenzima (apoDDC humana), pero antes deben aclararse algunos conceptos. En primer lugar, la hidrofobicidad no es una fuerza, sino que más bien es la ausencia de fuerza, como lo sería una interacción electrostática. Una molécula hidrofóbica va a tender a minimizar su exposición a un disolvente acuoso y se va a producir la formación de unas estructuras denominadas clatratos, formadas por moléculas de agua que se ordenan alrededor de estas estructuras hidrofóbicas, uniéndose a través de enlaces de hidrógeno entre ellas para minimizar el contacto con la superficie hidrofóbica.

Conocer la hidrofobicidad de los residuos de una proteína es importante para la predicción de estructuras secundarias, terciarias y cuaternarias, ya que los residuos hidrofóbicos van a tender a encerrarse en el interior de la cadena polipeptídica, mientras que los hidrofílicos tenderán a exponerse al disolvente polar. Por eso, se han creado escalas de hidrofobicidad, en las que se le asigna un valor determinado a cada uno de los 20 aminoácidos. Existen muchas escalas de hidrofobicidad, que se diferencian en el valor que se le asigna a cada aminoácido, que va a depender del modo empleado para determinar la hidrofobicidad. No obstante, estas escalas suelen ordenar del mismo modo los aminoácidos según su hidrofobicidad.

Existen distintos métodos para determinar la hidrofobicidad de los aminoácidos. Algunos de ellos son experimentales. Por ejemplo, puede estudiarse el coeficiente de reparto de cada aminoácido entre dos disolventes no miscibles. El problema de estos métodos experimentales es que se asume que la hidrofobicidad de un aminoácido es equivalente a la del residuo que queda tras su incorporación a una cadena polipeptídica. También existen métodos bioinformáticos, que suelen dar muy buenos resultados. Por ejemplo, puede hacerse un estudio estadístico con un gran número de ficheros de proteína consistente en analizar el porcentaje de veces que un residuo determinado aparece expuesto al disolvente o se encuentra enterrado en el interior de la cadena polipeptídica.

Una vez que disponemos de una escala de hidrofobicidad puede construirse un perfil hidrofóbico, que consiste en representar en un plano cartesiano los residuos de una proteína en el eje X y el valor de hidrofobicidad correspondiente en el eje Y. Esto podría indicarnos, por ejemplo, que una proteína posee segmentos transmembrana, y el número de veces que la cadena polipeptídica atraviesa la membrana. Sin embargo, las gráficas que se obtienen son muy ruidosas y esto puede impedir que pueda extraerse algún tipo de información. Esto puede solucionarse considerando la hidrofobicidad de cada residuo como una media de su valor de hidrofobicidad y la de x residuos por delante y por detrás en la secuencia primaria, lo que se conoce como una “ventana”. Cuanto mayor sea el tamaño de la ventana, menos ruido tendrá la gráfica. No obstante, si el tamaño de la ventana es demasiado grande se pierden máximos y mínimos que pueden ser importantes, perdiéndose esa información sobre la hidrofobicidad de la proteína. Por ello, es preciso llegar a un equilibrio. Este algoritmo para representar el perfil hidrofóbico se le conoce como formalismo de Kyte-Doolittle (Figura 1).

Figura 1: Formalismo de Kyte-Doolittle para la obtención del perfil hidrofóbico de una cadena polipeptídica. h_i es la hidrofobicidad ponderada del residuo i, r_j es un residuo j considerado en un instante para el cálculo de la hidrofobicidad ponderada y n es el tamaño de semiventana.

Otro parámetro que puede analizarse de una proteína es la anfipatía axial, que cuantifica las diferencias de hidrofobicidad que existen entre aminoácidos adyacentes. Esto permite hacer una predicción de la estructura secundaria de un segmento proteico y de su localización en la proteína. Por ejemplo, una hélice α localizada en la superficie de la proteína seguramente presentará una elevada anfipatía axial, de forma que podrá asemejarse a un cilindro que poseerá residuos polares en una mitad y residuos apolares en la otra, de modo que los residuos polares se orientarán hacia el disolvente acuoso, mientras que los apolares se orientarán hacia el interior de la proteína. Además, las cadenas polipeptídicas adquieren una estructura secundaria de forma que se maximice su anfipatía axial, por lo que calcular la anfipatía axial que resultaría de suponer que un segmento proteico presenta una estructura secundaria u otra puede ayudarnos a predecirla.

Para la modelización de la anfipatía axial pueden seguirse dos aproximaciones:

Eisenberg (Figura 2): está basada en el cálculo del momento hidrofóbico de una proteína.

Figura 2: Momento hidrofóbico de Eisenberg. µ_H es el momento hidrofóbico, H_n es la hidrofobicidad del residuo n y δ es la distancia angular, siendo de 100 º para las hélices α y de entre 160 y 180 º para las láminas β.

Stroud (Figura 3): está basada en el espectro de potencias de Fourier.

Figura 3: Espectro de potencias de Fourier de Stroud. I es el espectro de potencias, h_j es la hidrofobicidad del residuo j, h(k) es la media de la hidrofobicidad de los residuos considerados según el tamaño de la ventana, j es un residuo determinado y ν es la distancia angular siendo de 100 º para las hélices α y de entre 160 y 180 º para las láminas β.

Para calcular el perfil de hidrofobicidad y la anfipatía axial de la apoDDC humana se ha creado la aplicación Free Pascal hidrofobicidad.exe (Figura 4), así como las funciones CargarFASTA, calcularhidrofobicidad, eisenberg y stroud, presentes en la librería biotools. Cuando se utiliza este programa primero debe cargarse el fichero *.fasta de la proteína correspondiente. Este cambio con respecto a las actividades anteriores, en las que se seleccionaba un fichero *.pdb, se debe a que el fichero 3RBL.pdb está incompleto, no contiene la secuencia completa de la apoDDC humana, sino que solo aquellos residuos de los que se ha podido obtener sus coordenadas atómicas (ver actividades 6 y 7). En cambio, en el fichero 3RBL.fasta aparece toda la secuencia al completo. Además, este fichero contiene la secuencia de las dos subunidades de la proteína, lo que permite seleccionar una subunidad u otra.

Cuando se carga un fichero de proteína se selecciona por defecto la primera subunidad de la proteína y el perfil hidrofóbico y la anfipatía axial se calcula desde el primer residuo hasta el último. En la Figura 4 se han seleccionado tan solo los 20 últimos residuos de la primera subunidad, localizados en el extremo C-terminal.

Por otro lado, antes de que se inicien los cálculos tiene que cargarse también un fichero *.txt que contenga los valores de hidrofobicidad que se va a asociar a cada residuo. Para que el programa funcione este fichero tiene que tener un formato determinado:

La primera columna se corresponde con el código en una letra de un aminoácido concreto.
La segunda columna tiene que ser un espacio en blanco.
El resto de columnas de una fila tiene que contener el valor de hidrofobicidad especificado.

En este ejercicio vamos a seleccionar la tabla de hidrofobicidad ABORD, que contiene valores de hidrofobicidad que van desde el 0 al 10. También se puede seleccionar el tamaño de semiventana, siendo el valor mínimo 1, el máximo 20 y el valor por defecto 4. Para el cálculo del momento de Eisenberg y el espectro de potencias de Fourier de Stroud también es necesario seleccionar una distancia angular. Esta tendrá por defecto un valor de 100 º, que es la distancia angular correspondiente a las hélices α, aunque el usuario puede seleccionar la que desee.

Por último, en la parte inferior del programa se observan 3 listas que contienen los valores calculados para cada uno de los residuos seleccionados siguiendo los 3 tipos de algoritmo, mientras que en la parte derecha hay 3 objetos de tipo TPanel que permiten seleccionar el color de las gráficas.

Figura 4: Interfaz del programa hidrofobicidad.exe. Resultados obtenidos al calcular el perfil hidrofóbico y la anfipatía axial de los 20 últimos residuos de la subunidad A de la apoDDC humana, seleccionando una semiventana de 4 residuos y una distancia angular de 100 º.

Tal y como puede observarse en la Figura 4, la forma del gráfico del momento de Eisenberg y el espectro de potencias de Fourier de Stroud es bastante similar, aunque los valores en el eje Y sean muy distintos. Esto demuestra que ambas aproximaciones para calcular la anfipatía axial son equivalentes. El tamaño de semiventana de 4 da como resultado una ventana de 9 residuos, lo que hace que se suavicen demasiado las curvas, teniendo en cuenta que solo se han seleccionado 20 residuos. Por eso, la Figura 5 muestra el perfil hidrofóbico y la anfipatía axial de estos residuos, pero seleccionando una semiventana de 2 residuos (ventana de 5 residuos). Como puede verse, se obtienen gráficas más escarpadas, y aquí vemos cómo las gráficas correspondientes al momento de Eisenberg y el espectro de potencias de Fourier de Stroud también se parecen, aunque no tanto como cuando la semiventana tiene un valor de 4 residuos.

Figura 5: Resultados obtenidos al calcular el perfil hidrofóbico y la anfipatía axial de los 20 últimos residuos de la subunidad A de la apoDDC humana, seleccionando una semiventana de 2 residuos y una distancia angular de 100 º.

Una vez que ya sabemos cómo funciona este programa vamos a analizar el perfil hidrofóbico y la anfipatía axial de esta proteína. La Figura 6 muestra su estructura secundaria. Como puede verse, esta proteína está formada por 18 hélices α y 11 hebras β, que se agrupan en 2 láminas β de 7 y 4 hebras β. Vamos a comenzar analizando las hélices α del dominio N-terminal.

Figura 6: Estructura secundaria de las subunidades A y B (simultáneamente) de la apoDDC humana [3]. En la parte inferior aparece la leyenda. Los residuos se han indicado en código de una letra y el dominio al que pertenecen en color. En rojo se ha representado el dominio N-terminal, en azul el dominio L y en verde el dominio C-terminal (ver actividad 1).

La Figura 7 muestra el perfil hidrofóbico y la anfipatía axial del dominio N-terminal de la subunidad 1 de la apoDDC humana. Como este dominio no posee láminas β, solo se han analizado las hélices α, para lo que se ha seleccionado una semiventana de 4 residuos y una distancia angular de 100 º. Pueden observarse muchos máximos y mínimos locales en el caso del gráfico del momento de Eisenberg, aunque estos se encuentran suavizados en el espectro de potencias de Fourier de Stroud. El perfil hidrofóbico de este dominio es bastante homogéneo y, teniendo en cuenta que en la escala hidrofóbica escogida el máximo valor es 10, los aminoácidos presentan una hidrofobicidad de media a alta.

Figura 7: Perfil hidrofóbico y anfipatía axial del dominio N-terminal de la subunidad A de la apoDDC humana. Se ha seleccionado una semiventana de 4 residuos y una distancia angular de 100 º.

La primera hélice (H1) abarca desde el residuo 2 al 23. Según este gráfico, se trata de una hélice compuesta por residuos con una hidrofobicidad baja o intermedia y presenta una anfipatía axial bastante elevada en la parte central. La Figura 8 muestra esta hélice α en verde. Como puede verse, esta hélice α se encuentra en la superficie de la proteína. Esto encaja con el hecho de que sus residuos presenten hidrofobicidad baja (los que se orientan hacia el disolvente) e intermedia (los que se orientan hacia el interior de la proteína), así como el hecho de que estos residuos presentan una elevada anfipatía axial.

Figura 8: Representación en RasMol de la apoDDC humana con el esquema Ribbons y el modelo de color Structure. Se ha resaltado la H1 de la subunidad A en color verde.

La Figura 9 muestra una representación en RasMol de la H2 y H3. Estas hélices también se encuentran en la superficie. Debido a su pequeño tamaño, menor que el de la ventana, apenas se observan cambios en los gráficos de anfipatía axial, aunque puede observarse un máximo local en el gráfico del momento de Eisenberg para la H2 y otro máximo local en el gráfico del espectro de potencias de Fourier de Stroud para la H3 (Figura 11). Por otro lado, el gráfico de Kyte-Doolittle indica que estos residuos presentan una hidrofobicidad intermedia. Todo esto resulta coherente con hélices α superficiales. Sin embargo, se habría podido predecir mejor estas hélices α seleccionando un valor de semiventana más pequeño.

Figura 9: Representación en RasMol de la apoDDC humana con el esquema Ribbons y el modelo de color Structure. Se ha resaltado la H2 de la subunidad A en color verde y la H3 en color azul verdoso.

Figura 10: Perfil hidrofóbico y anfipatía axial del dominio N-terminal de la subunidad A de la apoDDC humana. Se ha seleccionado una semiventana de 4 residuos y una distancia angular de 100 º. Las circunferencias de color rojo indican los máximos locales de anfipatía axial correspondientes a las H2 y H3.

La Figura 11 muestra las H4 y H5. Como puede verse, estas hélices α también se localizan en la superficie de la proteína. Estas hélices presentan un perfil de hidrofobicidad con valores de hidrofobicidad intermedios y se corresponden con un máximo de anfipatía axial en ambos gráficos (Figura 12).

Figura 11: Representación en RasMol de la apoDDC humana con el esquema Ribbons y el modelo de color Structure. Se ha resaltado la H4 de la subunidad A en color verde y la H5 en color azul verdoso.

Figura 12: Perfil hidrofóbico y anfipatía axial del dominio N-terminal de la subunidad A de la apoDDC humana. Se ha seleccionado una semiventana de 4 residuos y una distancia angular de 100 º. Las circunferencias de color rojo indican los máximos de anfipatía axial correspondientes a las H4 y H5.

Por tanto, podemos ver cómo el perfil hidrofóbico y la anfipatía axial son herramientas muy útiles para predecir hélices α que se ubican en la superficie de la proteína: son hélices α con una hidrofobicidad intermedia y elevada anfipatía axial. Pero, ¿qué ocurre con una hélice α ubicada en el interior de la proteína? Para ello se ha analizado el perfil de hidrofobicidad y la anfipatía axial de los residuos del 358 al 369 de la subunidad A de la apoDDC humana, que comprenden la primera parte de la hélice α 18 (H18) (Figuras 13 y 14). En este caso se observa que la hélice α está compuesta por residuos altamente hidrofóbicos y que la anfipatía axial es mínima, tal y como cabría esperar. Por tanto, este programa también funciona para predecir hélices α localizadas en el interior de la proteína.

Figura 13: Representación en RasMol de la apoDDC humana con el esquema Ribbons y el modelo de color Structure. Se ha resaltado la primera parte de la H18 de la subunidad A en color verde.

Figura 14: Perfil hidrofóbico y anfipatía axial de los residuos del 320 al 400 de la subunidad A de la apoDDC humana. Se ha seleccionado una semiventana de 4 residuos y una distancia angular de 100 º. Los rectángulos de color rojo engloban a los residuos del 358 al 369, correspondientes con la primera porción de la H18.

Ahora vamos a comprobar si este programa es capaz de predecir estructuras de lámina β en una secuencia primaria. Para ello, vamos a seleccionar un tamaño de semiventana de 2 residuos (ventana de 5 residuos) y una distancia angular de 160 º (Figura 15). Estos residuos se han representado en verde en la Figura 16. Estas láminas β se encuentran por una cara en contacto con el disolvente hidrofílico y por otra enterradas en el interior de la proteína. Los valores de hidrofobicidad son entre intermedios y altos para tres hebras β y más bajos para la hebra β que abarca desde el residuo 438 al 440. Esto se debe a que es la hebra β más expuesta al disolvente de las 4 (Figura 16, en azul verdoso). Esto se traduce en que es la hebra β que presenta una menor anfipatía axial, porque está básicamente rodeada por moléculas de disolvente. En cambio, las otras hebras β presentan elevados valores de anfipatía axial, debido a que, aunque están más enterradas en el interior de la proteína, también están en contacto con el disolvente polar. Por tanto, este programa informático también es bastante útil para la predicción de hebras β en las proteínas.

Figura 15: Perfil hidrofóbico y anfipatía axial de los residuos del 380 al 460 de la subunidad A de la apoDDC humana. Se ha seleccionado una semiventana de 2 residuos y una distancia angular de 160 º. Los rectángulos de color rojo engloban a los residuos que presentan una estructura secundaria de lámina β.

Figura 16: Representación en RasMol de la apoDDC humana con el esquema Ribbons y el modelo de color Structure. En verde se han coloreado las hebras β del dominio C-terminal de la subunidad A. La hebra β que comprende los residuos del 338 al 340 se ha representado en color azul verdoso.

En función de lo que se ha visto en esta actividad puede concluirse que, aunque todavía no sea posible conocer la estructura tridimensional de una proteína a partir de su secuencia primaria, el estudio de su perfil hidrofóbico y de la anfipatía axial puede proporcionar mucha información sobre esta, simplemente utilizando herramientas tan básicas como las tablas de hidrofobicidad, que pueden construirse fácilmente.

Bibliografía

Apuntes de clase de la asignatura “Ingeniería de Proteínas” del Grado en Bioquímica.
https://wiki.freepascal.org/. Fecha de acceso: 19 de junio de 2019.
http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/cgi-bin/pdbsum/GetPage.pl?pdbcode=3rbl&template=protein.html&r=wiring&l=1&chain=A. Fecha de acceso: 19 de junio de 2019.
RasMol V2_7_2_1 Manual in Spanish.