Revisión bibliográfica de la apoDDC humana

Documentar y revisar bibliográficamente la proteína asignada. Se trata de una tarea a desarrollar a todo lo largo del Curso. Su objetivo es reunir los trabajos científicos clave y los datos necesarios para conocer lo mejor posible la proteína asignada a cada alumno haciendo particular énfasis en los aspectos estructurales y funcionales. Incluir la revisión en el cuaderno personal de actividades (CPA), con formato HTML.


1. Introducción

La dopamina, la serotonina, el ácido γ-aminobutírico (GABA) y la histamina son neurotransmisores sintetizados por 3 enzimas estructuralmente relacionadas ampliamente expresadas en el cerebro [1, 2] que utilizan el cofactor piridoxal 5’-fosfato (PLP) (Figura 1). Estas enzimas son la 3,4-dihidroxi-L-fenilalanina (L-DOPA) descarboxilasa (DDC), la ácido glutámico descarboxilasa (GAD) y la histidina descarboxilasa (HDC). Se trata de enzimas fundamentales, dado que su alteración está asociada con múltiples trastornos, como el Párkinson, el síndrome de Tourette, la esquizofrenia, la depresión o el cáncer [3-7]. Estas enzimas catalizan la descarboxilación de aminoácidos, transformándolos en sus correspondientes aminas (Figura 2).
Figura 1: Fórmula del piridoxal 5'-fosfato [8].
Figura 2: Esquema básico de una reacción de descarboxilación [21].
El mecanismo de la reacción catalizada por estas enzimas se desarrolla del siguiente modo (Figura 3):
  • En primer lugar, se produce la unión del PLP a la enzima mediante un enlace tipo base de Schiff entre el grupo aldehído del PLP y el grupo ε-amino del residuo de lisina localizado en el centro activo.
  • A continuación, se produce la unión del PLP al sustrato por medio de un enlace tipo base de Schiff y la separación del PLP y la enzima. El intermediario formado en el primer paso es más susceptible a atacar nucleofílicamente al grupo amino del sustrato que el grupo aldehído libre. En este paso se produce la liberación del grupo carboxilo del sustrato en forma de CO2.
  • Tras la catálisis el PLP queda unido al producto y un residuo de tirosina, con la participación de un residuo de histidina, dona un protón al Cα de este intermediario.
  • Por último, vuelve a producirse la unión entre el grupo aldehído del PLP y el grupo ε-amino de la lisina de la enzima como en el primer paso, se produce la liberación del producto y la base de Schiff PLP-enzima formada queda lista para un nuevo ciclo de catálisis [9].

Figura 3: Mecanismo de acción de la L-DOPA descarboxilasa [9].


El PLP constituye un mecanismo fundamental para la regulación de la actividad de estas enzimas [10] y atraviesa la barrera hematoencefálica en forma de sus precursores derivados de la vitamina B6, como el piridoxal, la piridoxina o la piridoxamina, que son fosforilados por la piridoxal quinasa (PLK) [11, 12]. Por tanto, la deficiencia de estos precursores en el sistema nervioso central o defectos en el gen de la PLK puede ser responsable de una alteración del equilibrio entre la forma apo- y holo- de estas descarboxilasas, lo que constituye el origen de muchas patologías neurológicas, como epilepsia o trastornos psiquiátricos [13, 14].
Se ha propuesto que estas tres descarboxilasas experimentan un gran cambio conformacional cuando se une el PLP, presentando una conformación más compacta y menos accesible al disolvente. Sin embargo, todavía no se conoce:
  • El mecanismo exacto de unión del PLP a estas enzimas.
  • Cómo de grande es este cambio conformacional que se produce cuando pasan de la forma apo- a la forma holoenzima.
  • Cuál es el motivo de que se produzca una degradación preferencial de la apoenzima.
  • Si la apoenzima se une a PLP libre in vivo o si, por el contrario, se produce una transferencia del PLP desde la PLK a través de una interacción proteína-proteína [15].

2. La L-DOPA descarboxilasa

Este cuaderno de actividades se va a centrar fundamentalmente en el estudio de la estructura de la L-DOPA descarboxilasa humana en forma apo- (apoDDC humana) (Figura 4), que cataliza la transformación de la L-DOPA en dopamina, participando el PLP en este proceso como cofactor. Se trata de una proteína de 107,96 kDa con estructura cuaternaria, dado que, como las otras dos descarboxilasas, esta enzima se trata de un homodímero. Cada monómero está compuesto por tres dominios:
  • Un dominio N-terminal formado por 3 hélices α.
  • Un gran dominio (dominio L) formado por una lámina β de 7 hebras rodeada por hélices α. Aquí se encuentra el centro activo, donde se une la molécula de PLP y a este la molécula de sustrato.
  • Un pequeño dominio C-terminal [16].

Figura 4: Estructura tridimensional de la apoDDC. a) La cadena A se ha representado en rojo y la cadena B en azul. b) Estructura secundaria: en rosa aparecen las hélices α, en amarillo las hebras β y en azul los giros β [17].

Este homodímero en humanos presenta una conformación completamente abierta en la forma apo- en la que cada uno de los dominios L se encuentra desplazado hasta 20 Å en comparación con la conformación de la holoenzima del riñón de cerdo, una enzima ortóloga cercana (Figura 5). Esta conformación abierta de la apoenzima tiene como resultado la exposición completa del dominio L al disolvente, que contiene el centro activo y regiones hidrofóbicas (Figura 6), mientras que el contacto entre las dos subunidades tiene lugar por medio de las hélices del dominio N-terminal. La escasa superficie de contacto entre las dos subunidades explica la gran movilidad que presenta cada una de ellas [15].

Figura 5: a) Representación de la apoDDC humana. b) Representación de la holoDDC de riñón de cerdo. Solo se representa en color un monómero, mientras que el otro monómero aparece en gris [15].

Figura 6: Representación de la apoDDC humana con los residuos coloreados según su carácter hidrofílico (rojo) o hidrofóbico (verde) [17].

3. Asimetría y estados conformacionales de la L-DOPA descarboxilasa

La estructura de las dos subunidades de la apoenzima no es simétrica, la subunidad A se encuentra en una conformación más cerrada que la subunidad B. Esto se refleja también al nivel del centro activo, de modo que la cadena A presenta una mayor afinidad por el cofactor que la cadena B. Por tanto, conforme aumenta la concentración de PLP, este primero se une a la cadena A y luego a la cadena B para que finalmente se origine la conformación cerrada característica de la holoenzima (Figura 7). Por tanto, existen hasta 4 conformaciones de la DDC: 
  • La conformación sin PLP.
  • La conformación propia de una ocupación de 0,5 por el PLP de la cadena A, es decir, cuando el PLP se encuentra en el centro activo de la cadena A, pero todavía no se ha formado la base de Schiff PLP-enzima.
  • La conformación característica de la situación en la que se ha producido la ocupación completa de la cadena A por el PLP (se ha formado la base de Schiff PLP-enzima), pero solo la ocupación de 0,5 por el PLP de la cadena B.
  • La conformación cerrada propia de la holoenzima en la que se ha producido la ocupación completa del centro activo de las dos cadenas [15].

Figura 7: Diferentes conformaciones en las que se puede encontrar el homodímero según el nivel de ocupación por PLP del centro activo de la cadena A y B [15].

4. Estados conformacionales del centro activo de la L-DOPA descarboxilasa

En estas 4 conformaciones del homodímero el centro activo puede presentar 5 conformaciones distintas, coloreadas de amarillo, azul, rosa, verde y morado en la Figura 7. La Figura 8 muestra específicamente los residuos que constituyen el centro activo de la DDC y sus posibles conformaciones, siguiendo el mismo código de colores. Como puede verse en ambas figuras, la conformación en la que se encuentra el centro activo en una de las cadenas del homodímero afecta a la conformación del centro activo del centro activo de la otra cadena, además de la ausencia o presencia de PLP (formando la base de Schiff PLP-enzima o no). La comparación de la estructura de la apoDDC humana (Figura 8.a) con la holoDDC de riñón de cerdo (Figura 8.e) indica que las mayores diferencias entre estos dos estados están en la disposición de los 7 últimos aminoácidos del bucle 1, que conecta el dominio N-terminal con el dominio L (residuos del 66 al 84), especialmente la tirosina 79 y la fenilalanina 80. En la apoproteína la tirosina 79 se encuentra formando un enlace de hidrógeno con la histidina 302 que no está presente en la holoenzima. El residuo de lisina 303 es el encargado de reaccionar con el PLP. En el paso de la forma apo- a holoenzima, este residuo se desplaza 6 Å, intercambiando su posición con la de la tirosina 274. Como consecuencia de estos cambios en la holoenzima aparece una interacción favorable de apilamiento aromático entre las cadenas laterales de los residuos triptófano 304, tirosina 274 y fenilalanina 80 que no están presentes en la apoenzima. Entre la forma abierta de la apoDDC y la forma cerrada de la holoDDC existen tres configuraciones posibles del centro activo (Figura 8.b, 8.c y 8.d). En la segunda conformación (Figura 8.b), correspondiente con la presencia de PLP en el centro activo de la cadena B abierta antes de haberse formado la base de Schiff, el anillo piridínico del PLP fuerza el intercambio de la posición de la tirosina 304 por la lisina 303, lo que facilita la formación de la base de Schiff. Por otro lado, cuando el PLP entra en el centro activo de la cadena A (Figura 8.c), se une como a la cadena B, aunque el bucle catalítico formado por los residuos del 300 al 310 se encuentra más próximo a la molécula de PLP como consecuencia de su conformación más cerrada (Figura 7). En esta situación, la histidina 302 se desplaza hacia la posición observada en la conformación del centro activo en la holoenzima (Figura 8.e), interaccionando con el grupo fosfato del PLP y esto provoca la ruptura del enlace de hidrógeno con la tirosina 79. Por otra parte, los residuos triptófano 304 y tirosina 274, dos de los tres residuos implicados en la interacción de apilamiento aromático, se posicionan como en el estado del centro activo de la holoDDC, mientras que la fenilalanina 80 conserva su conformación propia de la apoDDC. Por otro lado, el bucle 1 de conexión entre el dominio N-terminal y el dominio L todavía permanece en la conformación propia de la apoenzima, aunque presenta una menor rigidez. Cuando se forma la base de Schiff PLP-cadena A (Figura 8.d) entonces el centro activo adquiere una conformación casi idéntica a la del de la holoenzima (Figura 8.e). El bucle 1 se reordena completamente adquiriendo una conformación propia de la holoenzima y la cadena lateral de la fenilalanina 80 forma la interacción de apilamiento aromático con el triptófano 304 y la tirosina 274 propia de la conformación cerrada de la holoenzima. La única diferencia con la conformación de la holoenzima es la posición de la cadena lateral de la tirosina 79, que en la conformación abierta se encuentra expuesta al disolvente y en la holoenzima se produce un giro que hace que no lo esté [15].

Figura 8: Residuos del centro activo de la DDC y las distintas conformaciones que pueden adoptar. Las letras de la A a la E comparten el mismo código de colores que la Figura 7. Las líneas discontinuas hacen referencia al esqueleto peptídico del bucle 1 que conecta el dominio N-terminal con el dominio L en el estado apo- (rojo) u holo- (azul) [15].

5. Papel de los bucles en los desplazamientos conformacionales

Por tanto, la unión de PLP a la estructura abierta, que puede estar presente en solución como un conjunto dinámico de distintas conformaciones, provoca un cambio conformacional en el centro activo que provoca el reordenamiento del bucle 1 y esto favorece la transición hacia la conformación cerrada. El bucle 1 en la conformación cerrada contacta directamente con el bucle 2 de la otra subunidad (residuos del 100 al 110), que a su vez contacta con el bucle 3 de esta subunidad, conocido como el bucle flexible, pues es responsable del giro de la proteína (Figura 9). Los bucles 2 y 3 se encuentran en contacto con el disolvente en la conformación abierta de la DDC humana, mientras que en la conformación cerrada no. Por otro lado, el bucle 1 presenta un doble giro causado por la prolina 74 y su conformación se encuentra estabilizada mediante interacciones de apilamiento aromático adicionales establecidas con residuos del dominio C-terminal. Este doble giro permite que el triptófano 71 y otros residuos del bucle 1 interaccionen directamente con el bucle 2 de la otra subunidad mediante interacciones hidrofóbicas que comprenden, entre otros residuos, la tirosina 79 del bucle 1 de la primera subunidad y la fenilalanina 103 del bucle 2 de la otra subunidad. Además, tanto el bucle 1, como el bucle 2 (la fenilalanina 103) y el bucle 3 (bucle flexible) contienen residuos implicados en la unión del sustrato [18, 19, 20]. Esto refleja que la reorganización estructural del homodímero está estrechamente interconectada con su actividad catalítica. De las 23 mutaciones puntuales de la DDC identificadas en pacientes con trastornos relacionados con neurotransmisores 16 provocan la modificación de uno de estos aminoácidos que participan en el cambio conformacional de la apoDDC y la holoDDC [15].

Figura 9: Proximidad entre el bucle 1 de una subunidad y los bucles 2 y 3 (bucle flexible) de la otra subunidad [15].

6. Mecanismo de adición del PLP a la apoenzima

Como se ha mencionado antes, no se conoce si el PLP se transfiere directamente desde la enzima PLK o si se produce una interacción directa entre PLP libre y la enzima. En la conformación cerrada de la holoDDC de riñón de cerdo el único acceso al centro activo es a través de una pequeña apertura de 7 Å cargada positivamente (Figura 10.a). Por tanto, es más probable que la interacción de la enzima con la PLK se dé cuando se encuentra en la conformación abierta, lo que solucionaría el problema de que los residuos hidrofóbicos de la DDC se encontraran expuestos al disolvente, como se ha comentado anteriormente. Además, existe una gran complementariedad estructural entre el dímero PLK y la hendidura de la apoDDC. Por tanto, es posible que dos moléculas de PLP unidas a la PLK encajen perfectamente con los centros activos de la apoDDC abierta (Figura 10.b).

Figura 10: a) Acceso al centro activo en el dímero holoDDC de riñón de cerdo. En color se han representado las cargas negativas y en color azul las cargas positivas. Solo es visible el grupo fosfato del PLP. Complementariedad estructural entre el dímero PLK y la apoDDC humana [15].

7. Degradación selectiva in vivo de la apoenzima

Como se ha comentado anteriormente, existen evidencias de que in vivo se produce una degradación preferencial de la apoenzima. La apoDDC se degrada hasta 20 veces más rápido que la holoDDC en el cerebro de rata [10]. Esto podría explicarse por su conformación abierta de la apoDDC y la transición de una forma conformacional a otra podría conducir su ubiquitinación y degradación por el proteasoma. En concreto, las ubiquitín-ligasas reconocen zonas sin estructura o nuevas superficies expuestas de la proteína diana. La apertura del homodímero apoDDC implica que:
  • El área superficial accesible al disolvente incrementa en un 14%.
  • El centro activo y una gran parte de la interfase del dímero queda expuesta.
  • El bucle 2 y el bucle 3 (bucle flexible) quedan expuestos y se vuelven móviles o sin estructura.
  • El volumen global y la forma de la enzima cambian.
Por tanto, el sistema del proteasoma parece regular los niveles de DDC totales en el cerebro en función de la disponibilidad de PLP. La concentración de PLP en el cerebro afecta directamente a la relación entre la forma apo- y holo-. Si esta concentración es baja aumentará la concentración de apoenzima, que a su vez será degradada por el proteasoma. Por el contrario, el aumento de los niveles de PLP estimulará la transformación de la apoenzima en holoenzima, que es más estable (Figura 11) [15].

Figura 11: Mecanismo regulatorio de los niveles de DDC en el cerebro. PL = piridoxal, PN = piridoxina, PM = piridoxamina. En los vasos sanguíneos el PLP se transforma en PL, PN o PM por fosfatasas alcalinas inespecíficas asociadas a la membrana y estos derivados de la vitamina B6 atraviesan la barrera hematoencefálica. En las neuronas vuelven a transformarse en PLP por la PLK y se transfieren a la apoDDC, que se transforma en holoDDC. Esta lleva a cabo la síntesis de dopamina, mientras que la apoDDC es degradada preferentemente por el proteasoma.

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